凝膠過濾層析（gel filtration chromatography）法又稱排阻層析或分子篩方法，主要是根據(jù)蛋白質(zhì)的大小和形狀，即蛋白質(zhì)的質(zhì)量進(jìn)行分離和純化。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)物質(zhì)，多是交聯(lián)的聚糖類物質(zhì)，使蛋白質(zhì)混合物中的物質(zhì)按分子大小的不同進(jìn)行分離。
實(shí)驗(yàn)方法
蛋白質(zhì)的凝膠過濾分離
實(shí)驗(yàn)材料 蛋白質(zhì)
試劑、試劑盒 凝膠過濾緩沖液
儀器、耗材 布氏漏斗 凝膠過濾層析柱 分光光度計(jì)
實(shí)驗(yàn)步驟
1. 如果凝膠過濾的介質(zhì)是干粉，則需在凝膠過濾緩沖液中*溶脹。
2. 在遠(yuǎn)離過往通道及直接光照的恒溫環(huán)境，將層折柱垂直安裝在穩(wěn)固的實(shí)驗(yàn)室支架上。
3. 用一注射器將凝膠過濾緩沖液從柱子的輸出管注入柱子，至緩沖液達(dá)到柱子支持體平面之上，注射器留在輸出端以堵住柱子。
4. 沿著一根順柱子內(nèi)壁而放的玻璃棒將凝膠混懸物倒入柱子至所設(shè)高度，再小心往凝膠頂部加入1 cm 高的一層緩沖液，并連接緩沖液貯存容器，取去堵著柱子輸出管的注射器，用2~3倍柱床體積的緩沖液請(qǐng)洗柱子。
5. 流盡柱子凝膠頂部上面的緩沖液、關(guān)閉其輸出管。
6. 加入相當(dāng)于柱床體積1%~5%的蛋白質(zhì)樣品。開放輸出管，讓樣品流進(jìn)柱床，凝膠上面的柱子內(nèi)壁以緩沖液沖洗。
7. 在凝膠頂上用吸管加入1 cm 高的緩沖液層，重新與緩沖液貯存容器連接，開始洗脫。
8. 分部收集流出液。每分部相當(dāng)于1%總柱床體積，分別測每個(gè)分部的A280，并各取小份樣品測生物活性，選出有活性的分部用SDS-PAGE檢測所含蛋白質(zhì)的數(shù)量和質(zhì)量，合并含目標(biāo)蛋白的分部。
9. 用2~3個(gè)柱床體積的凝膠過濾緩沖液洗柱，柱子保存在含0.02%疊氮鈉的緩沖液中，柱于可無限次地使用。
收起
注意事項(xiàng) 切勿用磁力攪拌器攪拌，讓凝膠顆粒自然沉降，吸去或傾去不沉降的細(xì)小顆粒，或者根據(jù)廠商的使用指南進(jìn)行處理，對(duì)預(yù)溶脹的凝膠，在布氏漏斗或玻璃燒結(jié)漏斗中用大量緩沖液冼去防腐劑，重懸于等體積的凝膠過濾緩沖液，傾入*過濾瓶中，在使用前進(jìn)行脫氣。
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